KHÁI QUÁT VỀ HIỂN VI ĐIỆN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU
Trần Quang Huy, Nguyễn Thanh Thủy
PTN Siêu cấu trúc, khoa Vi rút,
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Giới thiệu chung
Hai nhà khoa học người Đức: Max Knoll và Ernst Ruska đã chế tạo ra kính hiển vi điện tử (Electron Microscope - EM) đầu tiên trên thế giới vào năm 1931. Phát minh này đã mở ra một kỷ nguyên mới cho việc nghiên cứu và quan sát những mẫu vật trong thế giới siêu vi mô. Năm 1986, Ernst Ruska đã được trao giải Nobel cho cụm công trình nghiên cứu về quang học điện tử trong đó có việc thiết kế kính hiển vi điện tử đầu tiên của ông.
Năm 1950, Latta và Hartman chế tạo ra máy cắt siêu mỏng (Ultramicrotome) dùng lưỡi dao thủy tinh để cắt mẫu vật thành những lát mỏng cỡ vài chục nanomet đã giúp cho phương pháp hiển vi điện tử trở lên hoàn thiện cả về phương diện thiết bị và kỹ thuật chuẩn bị mẫu. Sự ra đời của máy cắt siêu mỏng đã giúp cho các nhà nghiên cứu, đặc biệt là các nhà tế bào học và vi sinh vật học đi sâu nghiên cứu chi tiết siêu cấu trúc tế bào sinh vật, đưa ra được bức tranh chi tiết các bào quan của tế bào nhân chuẩn. Cũng chính nhờ hiển vi điện tử mà hàng loạt vi sinh vật cũng như vi rút lần đầu tiên được phát hiện trong những năm 1950-1980. Phân loại đầu tiên của vi rút học đã dựa vào hình thái vi rút khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử.
Ngày nay, kính hiển vi điện tử vẫn là một thiết bị nghiên cứu quan trọng trong nghiên cứu về khoa học sự sống và vật liệu (công nghệ nano). Trong lĩnh vực vi rút học, đây là thiết bị không thể thiếu, thiết bị này cho phép quan sát được hình thái siêu cấu trúc của hầu hết các loại vi rút gây bệnh, các đại phân tử như ADN, ARN… Với độ phân giải cao, cùng với những kỹ thuật chuẩn bị mẫu hiện đại, hiển vi điện tử còn cho phép các nhà vi sinh vật học, tế bào học…quan sát sự tương tác giữa vi rút gây bệnh và tế bào vật chủ, các đặc tính hóa miễn dịch tế bào. Việc chẩn đoán nhanh về hình thái, cấu trúc một số vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm vẫn là một lợi thế của hiển vi điện tử, đặc biệt là đối với những tác nhân gây dịch bệnh truyền nhiễm chưa xác định rõ nguyên nhân. Tuy nhiên, để phát huy được tối ưu hiệu quả của hiển vi điện tử trong nghiên cứu mẫu sinh vật thì việc kết hợp với các kỹ thuật chẩn đoán khác cũng trở nên rất cần thiết.
Hiển vi điện tử là một phương pháp nghiên cứu tương đối phức tạp và có nhiều kỹ thuật khác nhau, tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích nghiên cứu, các thiết bị phụ trợ và hoá chất cũng rất chuyên dụng. Vì vậy, người sử dụng EM trong nghiên cứu y sinh không những phải am hiểu về siêu cấu trúc tế bào, sinh hoá, vi sinh, miễn dịch, kiến thức chuyên ngành mà còn cần phải hiểu về các kỹ thuật chuẩn bị mẫu, khai thác thông tin từ hình ảnh và kiến thức nhất định về vật lý, hoá học.
Ở nước ta, kính hiển vi điện tử hiện nay vẫn là thiết bị quí hiếm, đắt tiền, có rất ít đơn vị được trang bị đồng bộ về kính hiển vi điện tử, thiết bị chuẩn bị mẫu và những người có kỹ năng vận hành và khai thác tính năng của kính. Do vậy, một số đơn vị được trang bị kính nhưng không khai thác được hoặc khai thác bị hạn chế, gây ra tình trạng lãng phí lớn về thiết bị. Hơn nữa, phần lớn các nhà nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên hay sinh viên trong nước không được trang bị kiến thức một cách đầy đủ để khai thác thông tin nhận được từ hiển vi điện tử. Họ thường gửi mẫu và phó mặc việc phân tích cho những người sử dụng kính hiển vi điện tử mà không quan tâm rằng những người này có hiểu về mục đích nghiên cứu đối với từng loại mẫu hay không. Nên biết rằng, những người sử dụng hiển vi điện tử có thể là chuyên gia về hiển vi điện tử thuộc lĩnh vực chuyên môn họ thường xuyên nghiên cứu, nhưng không phải họ biết tất cả các chuyên môn khác khi phân tích với kính hiển vi điện tử. Vì vậy, mỗi người khi cần nghiên cứu bằng phương pháp hiển vi điện tử thì hãy tìm hiểu để tự mình trở thành chuyên gia hiển vi điện tử đối với đối tượng mình nghiên cứu. Tức là người đó phải biết được cần chuẩn bị mẫu ở điều kiện như thế nào? quan sát trên kính ở chế độ nào? và những thông tin cần khai thác ra sao?, sau khi nhận được những hình ảnh hiển vi điện tử thì phải biết xử lý như thế nào để làm nổi bật được mục đích nghiên cứu của mình.
Phòng thí nghiệm hiển vi điện tử thuộc Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương là phòng thí nghiệm đầu tiên và duy nhất hiện nay của cả nước được trang bị cả kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét độ phân giải cao (SEM) cùng với hệ thống chuẩn bị mẫu hiện đại, đáp ứng hầu hết những nghiên cứu về hình thái, siêu cấu trúc vi sinh vật, các đặc tính hóa miễn dịch tế bào cũng như những vật liệu có kích thước nano. Đội ngũ nghiên cứu viên và kỹ thuật viên có kinh nghiệm, được đào tạo chuyên sâu trong và ngoài nước. Hàng năm, phòng thí nghiệm thường nhận tổ chức các khóa đào tạo ngắn hạn về kỹ thuật và phương pháp nghiên cứu hiển vi điện tử cho một số đơn vị có yêu cầu. Hiệu suất sử dụng thiết bị tại phòng thí nghiệm luôn duy trì ở mức cao, kết quả nghiên cứu có chất lượng.
Phòng thí nghiệm hiển vi điện tử thuộc Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương là phòng thí nghiệm đầu tiên và duy nhất hiện nay của cả nước được trang bị cả kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét độ phân giải cao (SEM) cùng với hệ thống chuẩn bị mẫu hiện đại, đáp ứng hầu hết những nghiên cứu về hình thái, siêu cấu trúc vi sinh vật, các đặc tính hóa miễn dịch tế bào cũng như những vật liệu có kích thước nano. Đội ngũ nghiên cứu viên và kỹ thuật viên có kinh nghiệm, được đào tạo chuyên sâu trong và ngoài nước. Hàng năm, phòng thí nghiệm thường nhận tổ chức các khóa đào tạo ngắn hạn về kỹ thuật và phương pháp nghiên cứu hiển vi điện tử cho một số đơn vị có yêu cầu. Hiệu suất sử dụng thiết bị tại phòng thí nghiệm luôn duy trì ở mức cao, kết quả nghiên cứu có chất lượng.
Các đặc tính của kính hiển vi điện tử
So sánh kính hiển vi điện tử (EM) với kính hiển vi quang học (LM)
Nguyên lý của kính hiển vi điện tử cơ bản cũng giống như kính hiển vi quang học. Mục đích của hai loại thiết bị này đều nhằm quan sát và nghiên cứu những mẫu vật mà mắt thường không nhìn thấy được. Tuy nhiên, để dễ hình dung ta có thể mô tả rằng kính hiển vi quang học dùng để quan sát tế bào, vi khuẩn, nấm và những vật có kích thước cỡ micromet trong thế giới vi mô, còn kính hiển vi điện tử có khả năng quan sát vi rút, các bào quan, các đại phân tử như ADN, ARN, tức là những vật có kích thước nằm trong dải nanomet trong thế giới siêu vi mô.
Đơn vị: 1nanomet (nm) = 10-3micromet = 10-6minimet (mm) = 10 -9met(m)
Những khác biệt cơ bản giữa kính hiển vi điện tử và kính hiển vi quang học được tóm tắt như sau:
- Trong LM, chùm sáng từ nguồn sáng trắng (bóng đèn) truyền qua tụ kính tới tiêu bản mỏng và phóng đại ảnh tiêu bản thông qua các thấu kính thuỷ tinh, ảnh được quan sát trực tiếp bằng mắt thường. Môi trường truyền chùm sáng và đỡ mẫu ở điều kiện không khí bình thường.
- Trong EM, chùm điện tử xuất phát từ nguồn phát xạ điện tử (Vonfram, LaB6 hay phát xạ trường) qua tụ kính (thấu kính điện từ) tới tiêu bản rất mỏng và phóng đại ảnh tiêu bản thông qua vật kính (thấu kính điện từ), thấu kính phóng (thấu kính điện từ), ảnh được quan sát trên màn huỳnh quang (hoặc màn hình nhờ camera kỹ thuật số). Môi trường truyền chùm điện tử và đỡ mẫu là chân không.
Bảng 1: Các đặc trưng của kính hiển vi điện tử truyền qua và kính hiển vi quang học
Các đặc trưng
|
Kính hiển vi điện tử
|
Kính hiển vi quang học
|
Chùm phát xạ
Bước sóng
Môi trường
Thấu kính
Góc mở
Năng suất phân giải
Độ phóng đại
Độ hội tụ
Độ tương phản
|
Chùm điện tử
0,0086nm (20kV) ~ 0,0025nm (200kV)
Chân không
Thấu kính điện từ
~ 35’
Điểm tới điểm: 0,35nm; Mạng: 0,14nm
x10 - x1.500.000 (thay đổi liên tục)
Điều khiển điện tử
Tán xạ, tương phản pha
|
ánh sáng
750nm (nhìn thấy) - 200nm (tử ngoại)
Khí quyển
Thấu kính thuỷ tinh
~ 700
Nhìn thấy: 200nm; Tử ngoại : 100nm
~ x2000 (thay thấu kính)
Điều khiển cơ học
Hấp thụ, phản xạ
|
Hình 1 mô tả sự giống nhau và khác nhau của kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử:
Hình 1. So sánh giữa kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử truyền qua và kính hiển vi điện tử quét
Các loại kính hiển vi điện tử
Hiện nay có hai loại kính hiển vi điện tử chủ yếu đó là kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét (SEM), ngoài ra còn có loại kết hợp tính năng của hai loại kính trên là hiển vi điện tử quét truyền qua (STEM).
Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope - TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua là một thiết bị hình trụ cao khoảng 2m, có một nguồn phát xạ điện tử trên đỉnh (súng điện tử) để phát ra chùm điện tử. Chùm này được tăng tốc trong môi trường chân không cao, sau khi đi qua tụ kính, chùm điện tử tác động lên mẫu mỏng, tùy thuộc vào từng vị trí và loại mẫu mà chùm điện tử bị tán xạ ít hoặc nhiều. Mật độ điện tử truyền qua ngay dưới mặt mẫu phản ảnh lại tình trạng của mẫu, hình ảnh được phóng đại qua một loạt các thấu kính trung gian và cuối cùng thu được trên màn huỳnh quang. Do vậy, ảnh hiển vi điện tử truyền qua là hình ảnh bề mặt dưới của mẫu (ảnh đen trắng) thu được bởi chùm điện tử truyền qua mẫu. Với độ phân giải cao cỡ 2A°, độ phóng đại từ x50 tới x1.500.000, TEM đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu siêu cấu trúc sinh vật, vi sinh vật và các vật liệu nano. Với những kính hiển vi điện tử độ phân giải cao (HR-TEM) để quan sát cấu trúc mạng của vật liệu nano thì điện thế gia tốc thường yêu cầu khoảng 150 kV trở lên. Ở Việt Nam vẫn chưa có kính hiển vi điện tử nào hoạt động đạt độ phân giải cao như HR-TEM tính đến thời điểm hiện tại.
Cấu tạo chính của TEM gồm cột kính với các bộ phận từ trên xuống dưới: súng điện tử, tụ kính, buồng đặt mẫu, hệ thống thấu kính tạo ảnh (vật kính, kính trung gian, kính phóng); buồng quan sát và bộ phận ghi ảnh.
Cột kính có chân không cao, áp suất 10-5-10-6 Torr đối với TEM thông thường và cỡ 10-8-10-10 Torr đối với HR-TEM). Hệ thống bơm chân không, hệ thống điện, điện tử, hệ thống điều khiển bằng máy tính là những bộ phận kèm theo để đảm bảo cho quá trình làm việc liên tục của TEM. Đặc trưng cho TEM là các thông số: hệ số phóng đại M, độ phân giải d và điện áp gia tốc U.
Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM1010, tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương có các thông số M=x50 - x600.000, d=3A0, U=40-100kV
Hình 2. Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM1010 (JEOL). Ảnh: Quang Huy
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM)
Kính hiển vi điện tử quét là thiết bị có khả năng quan sát bề mặt của mẫu vật, bao gồm: súng điện tử, tụ kính, buồng tiêu bản, hệ thống đầu dò điện tử, hệ thống khuếch đại - máy tính và màn hình để quan sát ảnh. Chùm điện tử xuất phát từ súng điện tử đi qua tụ kính, rồi vật kính, sau đó chùm tia hội tụ và quét trên toàn bộ bề mặt của mẫu, sự tương tác của chùm điện tử tới với bề mặt mẫu tạo ra các tia khác nhau (điện tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngược, điện tử Auger, tia huỳnh quang catot, tia X đặc trưng...). Hình ảnh hiển vi điện tử quét được phản ảnh lại bởi các điện tử thứ cấp và điện tử tán xạ ngược thu được nhờ các đầu dò gắn bên sườn của kính. Tia X đặc trưng có khả năng phản ánh thành phần nguyên tố trong mẫu phân tích nhờ bộ phân tích phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS – Energy Dispersive X- ray Spectroscopy).
Cấu tạo chính của SEM gồm cột kính (súng điện tử, tụ kính, vật kính), buồng mẫu và đầu dò tín hiệu điện tử. Cột kính có chân không cao, áp suất 10-5-10-6 Torr đối với SEM thông thường và 10-8-10-9 Torr đối với SEM có độ phân giải cao (FE-SEM) . Buồng mẫu có thể nằm ở hai chế độ chân không cao hoặc thấp. Hệ thống bơm chân không, hệ thống điện, điện tử, hệ thống điều khiển và xử lý tín hiệu là những bộ phận đảm bảo cho sự làm việc liên tục của SEM. Đặc trưng của SEM là các thông số: độ phóng đại M, độ phân giải d và điện áp gia tốc U.
Kính hiển vi điện tử quét phân giải cao tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương S-4800 (M: x25 - x800.000, d=1nm, U=0,5-30kV).
Hình 3. Kính hiển vi điện tử quét S-4800 (FE-SEM, Hitachi). Ảnh: Quang Huy
Kính hiển vi điện tử quét truyền qua (Scanning Transmission Electron Microscpe - STEM)
Kính hiển vi điện tử quét truyền qua là loại kính hiển vi điện tử có khả năng kết hợp cả hai tính năng quét và truyền qua, tức là có khả năng vừa phản ánh cầu trúc bên trong của mẫu đồng thời cũng có thể phản ánh được bề mặt, thành phần của mẫu vật. Tuy nhiên, loại kính này thường dùng nguồn điện tử là nguồn phát xạ trường (field emission gun), chân không trong toàn bộ cột kính phải rất cao cỡ 10-9 – 10-10 Torr. Loại kính này sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu vật liệu, ít sử dụng đối với các tiêu bản sinh vật.
Thiết bị chuẩn bị mẫu cho kính hiển vi điện tử
Máy cắt siêu mỏng
Máy cắt siêu mỏng mẫu là thiết bị cắt mẫu thành những lát cắt siêu mỏng. Lưỡi dao dùng để cắt làm bằng thuỷ tinh hoặc kim cương. Mẫu sinh vật (mô, tế bào, vi khuẩn, nấm...) hay vật liệu polymer có thể cắt thành những lát cắt siêu mỏng (30 nm - 80 nm) hoặc bán mỏng ~1mm. Tuy nhiên, những mẫu sinh vật thường phải cố định, hút nước và polyme hóa trước khi cắt mỏng. Mẫu sinh vật sau khi cắt mỏng được đưa lên lưới đồng hoặc nikel có 100 – 300 mắt lưới, đã phủ màng đỡ (formvar, collodion hoặc carbon) rồi nhuộm âm bản (uranyl acetate...) trước khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Ngoài ra, để duy trì nguyên vẹn các đặc tính sinh học cũng như hóa miễn dịch tế bào, mẫu sinh học có thể được cố định trong nitơ lỏng mà không cần phải xử lý hóa học, sau đó cắt bằng máy cắt lạnh siêu mỏng (cryo-ultramicrotome). Để có được những hình ảnh hiển vi điện tử chất lượng cao từ lát cắt siêu mỏng, người thực hiện phải có kinh nghiệm, khéo tay và tuân thủ đúng qui trình chuẩn bị mẫu và cắt mẫu.
Thiết bị làm khô mẫu
Thiết bị làm khô mẫu là thiết bị dùng để làm khô mẫu sinh vật trước khi quan sát mẫu trong SEM. Có hai loại thiết bị dùng làm khô mẫu là thiết bị làm khô mẫu ở điểm tới hạn và máy đông khô. Mục đích làm khô mẫu tại điểm tới hạn là giữ cho hình dạng, kích thước của những mẫu ngậm nước không bị thay đổi hay biến dạng khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét.
Thiết bị tạo màng mỏng dẫn điện
Có hai loại thiết bị tạo màng mỏng dẫn điện là thiết bị bốc bay trong chân không cao và máy phún xạ. Ngoài việc tạo ra được màng mỏng dẫn điện bằng kim loại vàng, platin-paladi...như thiết bị phún xạ dùng trong SEM, thiết bị bốc bay trong chân không cao còn dùng để tạo ra màng mỏng cacbon, tạo bóng kim loại làm tăng độ dẫn cũng như độ tương phản cho mẫu, hoặc cũng có thể in sao chép lại mặt mẫu (replica) để quan sát bằng hiển vi điện tử truyền qua.
Lưới và màng đỡ
Khi chuẩn bị mẫu cho kính hiển vi điện tử truyền qua, nhất thiết phải dùng lưới đỡ có kích thước tiêu chuẩn. Các loại lưới thường được làm bằng đồng, Nikel hoặc vàng có đường kính khoảng 3,05mm, số lượng mắt lưới khác nhau (100 - 300 mắt lưới). Trước khi làm tiêu bản sinh vật, lưới thường được phủ một lớp màng đỡ bằng collodion, formvar hay cabon... màng có độ dày khoảng 50 - 100 nm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Thanh Thủy, Trần Quang Huy. Atlas vi rút gây bệnh cho người. Nxb khoa học tự nhiên và công nghệ, 2010
2. Nguyễn Kim Giao. Hiển vi điện tử trong khoa học sự sống. Nxb Đại học QGHN 2004
3. Nguyễn Kim Giao. Hiển vi điện tử truyền qua. Nxb Đại học QGHN 2004
4. Nguyễn Kim Giao. Chẩn đoán vi rút gây bệnh trên người bằng phương pháp Hiển vi điện tử. Nxb Y học 2005
5. Miller SE. Detection and identification of viruses by electron microscopy. J Electron Microsc Tech 1986; 4:265-301.
6. Miller SE. Electron microscopy in rapid viral diagnosis. EMSA Bull 1989;
7. Miller SE. Diagnosis of viral infection by electron microscopy. In: Lennette EH, Lennette DA, Lennette ET (eds): Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections. Washington, American Public Health Assoc, 1995, pp 35-76.
8. Payne CM. Electron microscopy in the diagnosis of infectious diseases. In: Connor DH, Chandler FW, Schwartz DA, Manz HJ, Lack EE (eds): Pathology of Infectious Diseases, Chapter 2, Vol 1. Stamford,
9. M Hoppert and Holzenburg, Electron microscopy in Microbiology (1998)
0 nhận xét:
Đăng nhận xét