QUAN SÁT MẪU VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ TRUYỀN QUA

QUAN SÁT MẪU VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ TRUYỀN QUA

TS. Trần Quang Huy -Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương

MỤC TIÊU:

-         Hiểu được vai trò của kính hiển vi điện tử truyền qua trong quan sát và nghiên cứu mẫu vi sinh vật.

-         Hiểu được những yêu cầu về hóa chất, loại mẫu bệnh phẩm và phương pháp chuẩn bị mẫu  để quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi điên tử truyền qua.

-          Có khả năng nhận dạng được hình thái của một số loại virus gây bệnh.

Tóm tắt:

Kính hiển vi điện tử là thiết bị sử dụng chùm phát xạ điện tử để quan sát và phân tích hình dạng, kích thước cũng như cấu trúc siêu vi mô của mẫu vật. Trong bài viết này, các tác giả chỉ tập trung giới thiệu vai trò của kính hiển vi điện tử truyền qua và một số kỹ thuật chuẩn bị mẫu cơ bản để quan sát và nghiên cứu mẫu vi sinh vật (virus, vi khuẩn, nấm…) gây bệnh. Để dễ hiểu hơn, phần cuối bài viết là những hình ảnh của một số virus gây bệnh phổ biến ở Việt Nam được phân tích tại phòng thí nghiệm Siêu cấu trúc (PTN Hiển vi điện tử trước đây) của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là virus, thường có kích thước rất nhỏ so với giới hạn phân giải của các loại kính hiển vi quang học có mặt trên thị trường hiện nay. Do vậy, để quan sát chi tiết về hình thái cũng như cấu trúc siêu vi mô của vi sinh vật, chỉ có thể sử dụng kính hiển vi điện tử hoặc các thiết bị quan sát có độ phân giải cao (~A⁰, nm). Kính hiển vi điện tử dùng nguồn phát xạ có bước sóng rất ngắn (chùm điện tử) nên có độ phân giải rất cao và có khả năng được phóng đại hình ảnh của vi sinh vật lên hàng chục đến hàng triệu lần [1].

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope - TEM) được các nhà vật lý học phát minh và chế tạo từ những năm 1930 và có độ phân giải lớn hơn rất nhiều lần so với kính hiển vi quang học, do thiết bị này sử dụng chùm điện tử thay thế cho chùm ánh sáng để quan sát mẫu vật [1-3]. Bằng việc tìm ra kỹ thuật nhuộm âm bản cho các mẫu sinh học để quan sát dưới kính hiển vi điện tử, hàng loạt virus đã được nhận dạng nhờ sự khác biệt về hình thái, kích thước cũng như sự sắp xếp cấu trúc capxome trên bề mặt hạt virus [1]. Trong những năm 1970 - 1980, hiển vi điện tử truyền qua đóng vai trò rất lớn trong việc phân loại virus gây bệnh thành các nhóm như adenovirus, enterovirus, paramyxovirus, reovirus… Kỹ thuật nhuộm âm bản hiển vi điện tử đã được xây dựng thành thường quy trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán để phát hiện virus gây bệnh như: virus đậu mùa, virus adeno, virus rota, virus polio…[2-4]. Bên cạnh đó, việc tìm ra kỹ thuật lát cắt siêu mỏng đã giúp các nhà sinh học khám phá về siêu cấu trúc tế bào, vi khuẩn, quá trình tương tác giữa virus và tế bào cảm nhiễm (quá trình xâm nhập, nhân lên và giải phóng virus ra khỏi tế bào) [1]. Chính vì vậy, việc phát minh ra kính hiển vi điện tử đã tạo ra một cuộc cách mạng lớn trong lĩnh vực sinh học tế bào và virus học.

Từ những năm 1990 trở lại đây, thường qui kỹ thuật hiển vi điện tử trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán để phát hiện virus đã dần bị thay thế bởi một số kỹ thuật khác có độ nhạy cao hơn như kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA-Enzyme Linked Immunosorbent Assay), kỹ thuật sinh học phân tử (PCR-Polymer Chain Reaction)…[2]. Tuy nhiên, các kỹ thuật này đòi hỏi phải đáp ứng đầy đủ về thiết bị, hóa chất cũng như sinh phẩm chẩn đoán chuyên dụng và đặc biệt không áp dụng được để chẩn đoán các bệnh mới, lạ chưa rõ nguyên nhân. Trong khi, mẫu bệnh phẩm có thể được thu thập và kiểm tra trước bằng kính hiển vi điện tử mà không cần thay đổi nhiều về thường qui kỹ thuật. Nhờ đó, kết quả trực quan ban đầu có thể được ghi nhận để định hướng cho các kỹ thuật khác có độ nhạy cao hơn nhằm xác định chính xác tác nhân gây bệnh. Do vậy, kính hiển vi điện tử vẫn có vai trò không thể thay thế trong việc xác định tác nhân virus mới gây bệnh. Tóm lại, hiển vi điện tử ngày nay được chuyển từ trạng thái “thường qui” sang mục đích “trợ giúp” cho các kỹ thuật chẩn đoán khác trong phát hiện virus mới gây bệnh và nghiên cứu những đặc trưng về sự thay đổi siêu cấu trúc tế bào, hóa miễn dịch tế bào, vi khuẩn, quá trình tương tác giữa các hạt virus và tế bào cảm nhiễm, độc tố tế bào của vật liệu nano, kiểm tra tính toàn vẹn về hình thái của vắc xin virus.

Trong bài này, các tác giả giới thiệu chi tiết hai qui trình kỹ thuật quan trọng được sử dụng phổ biến cho kính hiển vi điện tử truyền qua để quan sát và nghiên cứu về vi sinh vật gây bệnh, bao gồm: kỹ thuật nhuộm âm bản và kỹ thuật lát cắt siêu mỏng.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 

2.1. Hóa chất, thiết bị

- Glutaraldehyde - CH₂(CH₂CHO)₂, cacodylate – (CH₃)₂AsO.OH, osimium tetroxide - OsO₄, ammonium acetate – CH₃COONH₄, bacitracin-C₆₆H₁₀₃N₁₇O₁₆S, uranyl acetate (UA) – UO₂(CH₃COO)₂.2H₂O, photphotungstic acid (PTA)– H₃PW₁₂O₄₀, propylen oxide – C₃H₆O, cồn –C₂H₅OH, chì citrate – C₁₂H₁₀O₁₄Pb₃, lưới đồng (200 – 300 mắt lưới, đã phủ màng mỏng collodion hoặc formvar), bộ kit epoxy – Epon 812, con nhộng gelatin đường kính 5 mm, kẹp gắp lưới đồng, đĩa petri đựng lưới, giấy thấm Whatman loại 1, giấy parafin, nước cất hai lần.

- Thiết bị: kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), máy cắt siêu mỏng (ultramicrotome), tủ an toàn sinh học bậc 2, hủ hút khí độc, tủ lạnh, máy đo pH, tủ ấm 37-60⁰C.

  

2.2. Loại mẫu phân tích

2.2.1. Bệnh phẩm từ dịch tiết cơ thể

- Đối với mẫu bệnh phẩm từ dịch tiết của cơ thể, vi sinh vật được nhận dạng bằng kỹ thuật nhuộm âm bản. Tuy nhiên, đối với virus để quan sát được bằng kính hiển vi điện tử nồng độ phải đạt được từ 10⁵ – 10⁶ hạt/ml. Tùy thuộc vào từng loại bệnh phẩm mà mẫu có thể được soi trực tiếp hay phải qua xử lý cô đặc bằng ly tâm, siêu ly tâm hay  agar. Ví dụ, loại mẫu bệnh phẩm chứa virus được tiến hành soi trực tiếp: phân (virus rota; adeno; corona và bại liệt); dịch nốt phồng (virus Herpes; thủy đậu và họ đậu); dịch ngoáy họng, tỵ hầu, dịch rửa phế quản (virus hợp bào đường hô hấp, cúm, sởi, quai bị, rubella, đường ruột, Herpes và adeno...); nước tiểu (virus adeno, sởi, quai bị và rubella) và nước mắt (virus adeno và Herpes). Để phát hiện virus trong dịch não tủy (virus đường ruột, coxsackie, Echo, EV71, adeno, Herpes, sởi và quai bị) hoặc máu/huyết thanh (virus viêm gan A, B, C và Dengue), mẫu phải được xử lý bằng siêu ly tâm hay thạch agar để tăng nồng độ virus trước khi nhuộm âm bản.

2.2.2 Bệnh phẩm lâm sàng từ các tổ chức, mô.

- Những mẫu bệnh phẩm lâm sàng thuộc các tổ chức, mô thì vi sinh vật có thể được nhận dạng bằng kỹ thuật lát cắt siêu mỏng. Ví dụ: não (virus Herpes, adeno, sởi, viêm não Nhật Bản, dại và họ đậu); gan (virus viêm gan A, B, E; adeno và Herpes); phổi (virus Herpes, hợp bào đường hô hấp, cúm, á cúm, corona, sởi, quai bị và adeno); da (virus Herpes, họ đậu, sởi, rubella, coxackie, nấm và vi khuẩn...); mắt (virus Herpes, adeno và rubella); thận (virus Herpes và adeno); tim (adeno, coxsackie và rubella) và ruột (virus Herpes, corona, bại liệt, rota, adeno và vi khuẩn).

2.2.3 Mẫu virus phân lập

- Dịch nổi tế bào sau gây nhiễm: virus được nhận dạng trực tiếp bằng kỹ thuật nhuộm âm bản. 

- Trên tế bào sau gây nhiễm: virus được nhận dạng bằng kỹ thuật lát cắt siêu mỏng. Phương pháp này cũng được sử dụng để phân tích và đánh giá sự nhân lên của virus trên tế bào, những biến đổi và tương tác của các thành phần tế bào theo từng giai đoạn và thời gian gây nhiễm.

2.2.4 Mẫu vắc xin virus

- Mẫu vắc xin virus sau khi tinh chế, cô đặc, có thể quan sát và đánh giá trực tiếp về mặt hình thái học bằng phương pháp nhuộm âm bản, như một số vắc xin virus sản xuất tại Việt Nam: vắc xin viêm não Nhật Bản, vắc xin viêm gan B, vắc xin viêm gan A, vắc xin dại, vắc xin bại liệt…

2.2.5 Mẫu vi khuẩn trên thạch

- Vi khuẩn sau khi được nuôi cấy trên đĩa/ống thạch có thể quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi điện tử truyền qua nhờ phương pháp nhuộm âm bản hoặc cũng có thể phân tích cấu trúc vi khuẩn sử dụng phương pháp lát cắt siêu mỏng.

Chú ý: Do buồng mẫu của kính hiển vi điện tử  hoạt động ở trạng thái chân không cao (10^-3 – 10^-5 Torr), nên tất cả mẫu vi sinh vật phải được chuẩn bị cẩn thận để cố định cấu trúc mẫu cũng như hút nước (làm khô) trước khi quan sát.

2.3. Phương pháp chuẩn bị mẫu

3.1. Kỹ thuật nhuộm âm bản (Negative staining) [1,5]

- Nhuộm âm bản là kỹ thuật sử dụng muối kim loại nặng như uranyl acetate (UA) hay photphotungstic acid (PTA) để nhuộm bề mặt mẫu vi sinh vật, nhằm làm tăng khả năng tán xạ điện tử để mẫu có độ tương phản tốt hơn.

- Uranyl acetate (UA):

+ 0,5% UA/nước cất để nhuộm vi khuẩn

+ 1%- 2% UA/nước cất 2 lần để nhuộm mẫu có kích thước: 60 nm – 100 nm

+ 3% UA/nước cất 2 lần để nhuộm virus có kích thước nhỏ hơn 60 nm.

- Photphotungstic acid (PTA): 0,25% PTA/nước cất hai lần (pH 2,5) dùng để nhuộm mẫu kích thước lớn hơn 80 nm, virus có vỏ bao ngoài như: virus cúm, dại, herpes, sởi, RSV...

Kỹ thuật nhuộm âm bản cho phép quan sát được hình thái và kích thước của vi sinh vật (virus, vi khuẩn, xạ khuẩn, vắc xin virus... )

Các bước tiến hành như sau:

1-        Sử dụng miếng parafin sạch để nhỏ các giọt dung dịch theo thứ tự lên bề mặt.

2-        Đặt lưới đồng (có màng đỡ) lên bề mặt giọt 0,01% bacitracine/nước cất trong 5 phút để tăng sự hút bám mẫu.

3-        Chuyển lưới sang giọt mẫu trong 10 phút để hấp phụ vi sinh vật lên màng đỡ trên bề mặt lưới.

4-        Chuyển lưới sang giọt dung dịch cố định 1% glutaraldehyte/nước cất  trong 5-10 phút để cố định mẫu.

5-        Chuyển lưới sang giọt dung dịch 0,1% amonium acetate/nước cất trong 5 phút để rửa phần dung dịch dư thừa và các phần tử gắn kết không chắc chắn.

6-        Nhuộm lưới bằng dung dịch 0,5-3% uranyl acetate/nước cất trong 3-10 phút (tùy theo loại vi sinh vật, vi sinh vật kích thước càng nhỏ thì thời gian nhuộm càng lâu) để tăng độ tương phản của mẫu.

7-        Để lưới khô trong không khí và quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.

(Giữa các bước chuyển phải hút kiệt dịch thừa bằng giấy thấm Whatman loại 1)

3.2. Kỹ thuật lát cắt siêu mỏng (Ultrathin sectioning) [1,5]

- Kỹ thuật lát cắt siêu mỏng cho phép cắt mẫu thành các lát cắt với bề dày cỡ vài chục nano mét (nm), giúp các nhà nghiên cứu quan sát trực tiếp hình thái, siêu cấu trúc vi sinh vật.

- Trước tiên, mẫu được cắt sơ bộ (nếu là mẫu mô) hoặc ly tâm (nếu là tế bào nuôi cấy, vi khuẩn, nấm) thành những hình khối có thể tích cỡ 1 mm³, sau đó cố định trong dung dịch thích hợp, hút nước bằng cồn theo các nồng độ khác nhau. Tẩm, đúc bằng Epon chuyên dụng và sau đó polyme hóa trong tủ ấm 60°C. Mẫu sau đó được cắt thành các lát siêu mỏng và đưa lên lưới đồng đã phủ màng (collodion hoặc formvar) để nhuộm trước khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (hình 1).

Hình 1. Mô tả các bước tiến hành của kỹ thuật lát cắt siêu mỏng.

Các bước được tiến hành như sau:

1-     Cắt mẫu nhỏ thành những hình khối cỡ 1 mm³ (nếu là mẫu tổ chức, mô…), hoặc ly tâm tạo pellet (nếu mẫu là vi khuẩn nuôi cấy)

2-     Cố định mẫu trong dung dịch 2,5- 3% glutaraldehyte/cacodylate 0,2M, pH= 7,2- 7,4 (trong 1 giờ ở  nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở nhiệt độ 4⁰ C)

3-     Nạo nhẹ tế bào cho vào týp eppendorf, ly tâm 3000v/5 phút (nếu mẫu là virus nuôi cấy trên tế bào trong chai).

4-     Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate 0,1M (5 phút/lần x3 )

5-     Cố định lần 2 bằng 1% OsO₄/ cacodylate 0,1M trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng

6-     Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate 0,1M (5 phút/lần x2)

7-     Hút nước bằng cồn các nồng độ 50⁰,70⁰,80⁰, 90⁰,100⁰ (5 phút/lần x2 tương ứng với mỗi nồng độ)

8-     Loại bỏ cồn bằng propylen oxide (5 phút/lần x3)

9-     Tẩm:

           + Propylen oxide: Epon= 1:1 (30 phút/ 2 lần)

           + Epon nguyên chất qua đêm

10- Đúc mẫu bằng epon nguyên chất trong con nhộng gelatin ở 60⁰C trong 48 giờ.

11- Cắt mẫu đã đúc bằng máy cắt siêu mỏng, độ dày lát : 30 – 50 nm, mẫu được đặt trên lưới đồng đã phủ màng.

12- Nhuộm lưới có mẫu với uranyl acetate 5% trong 10 phút và chì citrate 5 phút.

13- Để khô tự nhiên và quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua.

4. HÌNH ẢNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ CỦA MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH [5,6]

4.1  Virus adeno

Hình 2. Virus adeno trong dịch nổi tế bào (đầu mũi tên, nhuộm âm bản với UA 1%), virus adeno còn nguyên các ăngten (hình nhỏ góc trái, nguồn: Stannard L.M.); (b) virus adeno (mũi tên) nhân lên và kết đám thành dạng tinh thể trong nhân tế bào hep-2 (kỹ thuật lát cắt siêu mỏng), (JEM 1010, JEOL). Nguồn: PTN Siêu cấu trúc - Viện VSDTTƯ.

4.2  Virus herpes simplex

Hình 3. (a) Virus herpes simplex trong dịch nổi tế bào (nhuộm âm bản với PTA 0,25%); (b) virus herpes simplex (đầu mũi tên) bám xung quanh tế bào Vero (kỹ thuật lát cắt siêu mỏng), (JEM 1010, JEOL). Nguồn: PTN Siêu cấu trúc - Viện VSDTTƯ.

4.3  Virus rota

Hình 4. (a) Virus rota trong dịch nổi tế bào (nhuộm âm bản với UA 1%); (b) virus rota (đầu mũi tên) nhân lên trong tế bào Vero (kỹ thuật lát cắt siêu mỏng), (JEM 1010, JEOL). Nguồn: PTN Siêu cấu trúc - Viện VSDTTƯ.

4.4  Virus cúm A/H₅N₁

Hình 5. (a) Virus cúm A/H₅N₁ trong dịch nổi tế bào (nhuộm âm bản với PTA 0,25%); (b) virus cúm A/H₅N₁dạng cắt dọc (mũi tên) và dạng cắt ngang (đầu mũi tên) trên màng tế bào Vero (kỹ thuật lát cắt siêu mỏng), (JEM 1010, JEOL). Nguồn: PTN Siêu cấu trúc - Viện VSDTTƯ.

TỰ LƯỢNG GIÁ

1.        Trình bày kỹ thuật nhuộm âm bản cho kính hiển vi điện tử để nhận dạng vi sinh vật?

2.        Trình bày kỹ lát cắt siêu mỏng cho kính hiển vi điện tử để phân tích siêu cấu trúc của vi sinh vật?

3.        Phân biệt sự giống và khác nhau giữa hình ảnh hiển vi điện tử của một số virus sử dụng kỹ thuật nhuộm âm bản và kỹ thuật lát cắt siêu mỏng?

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.        Biel S.S., Gelderblom H.R., Electron microscopy of viruses. In: Cann AJ (ed.). Cell Culture - A Practical Approach. Oxford University Press, 1999

2.        Roingeard P., Viral detection by electron microscopy: past, present and future. Biology and Cell, 100 (2008) 491-501.

3.        Hazelton P.R., Gelderblom H.R., Electron microscopy for rapid diagnosis of infectious agents in emergent situations. Emerging Infectious Diseases, 9 (2003) 294 – 303

4.        Massimo G., Gelderblom H.R., Rapid viral diagnosis: role of electron microscopy. The new microbiologica, 28 (2005) 1 – 12

5.        Nguyễn Thanh Thủy, Trần Quang Huy. Atlas virus gây bệnh cho người. Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ, 2011 (222 trang).

6.        Thuy N.T., Huy T.Q., Thoa D.T., Lien N.M., Dung N.T., Irene D., Benedetti E.L., Izumi S.I., Man N.V., 2010. Ultrastructural features of H5N1 avian Influenza virus in Vero cell line. Journal of Electron Microscopy Technology for Medicine and Biology 24 (2010) 14 – 18.

Posted in: Phổ biến kiến thức